Методики биотестирования с помощью представителей семейства рясковых

Проведении биотестирования с помощью видов семейства рясковых можно проводить на нескольких уровнях:

• на уровне клетки ( метод основанный на реакции ингибирования фототаксиса , А.Г.Ломагин, Л.В.Ульянова, 1993.),
• на уровне органов ( фиксация морфологических отклонений растений ряски от нормы под действием загрязнителя: хлорозы, пожелтения, увядания листьев, специфические реакции),
• на уровне организма и популяции ( метод подсчета реализации репродуктивного потенциала, метод витального окрашивания ).

1. Кристаллизаторы на 2-5 л. для содержания маточной культуры.
2. Люминостат.
3. Чашки Петри (4 шт. на контроль и на каждую из концентраций изучаемого материала).
4. Пипетки на 3 - 5 мл.
5. Микрошпатель.
6. Бинокулярный микроскоп.
7. Центрифуга.
8. Камера Богорова.

Ингибирование фототаксиса.
Метод основан на реакции ингибирования фототаксиса. В качестве показателя изменения функционирования клетки используется число хлоропластов в эпистрофном положении. Для этого листецы ряски из опытного образца помещали в центрифугу лабораторную, клиническую ОПН-3 на время 10-15 минут при максимальном числе оборотов в минуту - 3000 . После этого отбирали листецы и помещали их в каплю воды на предметное стекло.

Хлоропласты в клетках хлоренхимы верхней стороны листеца и части таллома благодаря положительному фототаксису находились у верхней стенки клеток в эпистрофном положении, т.е. перпендикулярно лучам света. Не сдвигая препарата, в микроскопе создавали сильное освещение объекта, близкое к максимально возможному, но не повреждающему клетки.

Через 10 минут освещение объекта уменьшали до удобного для микроскопирования и при 400-кратном увеличении подсчитывали число хролопластов в эпистрофном положении. В варианте "эталон" (дистиллированная вода) число их минимально, поскольку большая часть хлоропластов отходит благодаря отрицательному фототаксису в парастрофное положение, прижимаясь к боковым стенкам и поворачиваясь ребром к лучам света .

Фиксация морфологических отклонений.
Фиксация морфологических отклонений растений ряски от нормы под действием загрязнителя: хлорозы, пожелтения, увядания листьев, специфические реакции. Исторически именно морфологические реакции организмов на техногенные факторы вошли в практику оценки качества среды. Биологическими параметрами являются изменение окраски листеца : пожелтение, побурение, потеря интенсивности окраски. Этот метод лег в основу методов машинного анализа фирмы Lemna Tec, где учет ведется с помощью сканалайзера, идентифицирующего листецы по цветовой гамме: темно-зеленые, зеленые, желтые, бурые, белые, хлорозы листа.

Метод подсчета реализации репродуктивного потенциала.
Для оценки воздействия загрязнителя выбрано время удвоения численности (t удв), рассчитываемое через коэффициент мгновенного роста популяции (r), изменение которого отражает сопротивление среды, т.е. характеризует сумму всех лимитирующих факторов среды, препятствующих реализации репродуктивного потенциала (r max), который рассчитывается по контролю.

По истечению времени экспозиции в контроле и в каждой концентрации просчитывается общее количество листецов, включая материнские особи и листецы, отделившиеся от материнской особи.

В контроле и в каждой концентрации на основании полученных результатов рассчитывается коэффициент мгновенного роста популяции ( r )

где N0 - начальная численность листецов; Nt - конечная численность листецов; t - время экспозии (сутки).

Далее по каждому t рассчитывается время удвоения численности (t удв) :

Показатель изменения времени удвоения численности ряски в исследуемых растворах по отношению к контрольному, выражается в процентах (Dt):

свидетельствует о качестве испытываемого водного раствора. Статистически достоверным следует считать отклонение более ±20% от времени удвоения в контроле. Отклонение в сторону увеличения при токсикологическом анализе возможно в исключительных случаях подпорогового воздействия концентраций токсикантов при биомониторинге - в случае увеличения эвтрофикации. Отклонение в сторону уменьшения при токсикологическом анализе показывает степень воздействия токсиканта, при биомониторинге - уменьшение эвтрофикации воды или присутствие токсикантов.

Метод витального окрашивания.
Метод основан на окрашивании мертвых клеток - красителем сафронином. Живые клетки сильно ограничивают проницаемость внутрь органических веществ, и помещенные в раствор красителя практически не окрашиваются. В мертвые клетки краска проникает свободно, благодаря чему их можно сразу обнаружить и учесть (В.Д.Пашкович, Б.С.Юдин, 1978). В качестве красителя используется сафранин, поскольку он обладает способностью хорошо окрашивать стенки клеток. Сафранина 0,25 грамм растворяют в 100 мл 10%-ного спирта (З.П.Паушева,1980; Методические указания по цитологической и цитоэмбриологической технике., 1991). Количество окрашенных клеток в процентном отношении к общей площади листеца принят за показатель токсичности поллютантов (Л.В.Цаценко, Н.Г.Малюга, 1998).

Исследования проводятся в длительном многофакторном стационарном опыте с 1992 г., заложенном на экспериментальном поле КГАУ.

Почва опытного участка - выщелоченный сверхмощный малогумусный чернозем.

Стационарный многофакторный опыт представлен следующими факторами: фактор А - плодородие почвы; фактор В - система удобрений; фактор С - система защиты растений и фактор Д - система основной обработки почвы. В опыте создано четыре модели уровней плодородия почвы на основе существующих нормативных показателей за счет внесения под первую культуру севооборота сахарную свеклу органоминеральных удобрений. Для создания фона А1 вносили 200 кг/га Р2О5 и 200 т/га подстилочного навоза. Для создания фона А2 - дозы удобрений удваивались, а фона А3 - утраивались; А0 - естественный фон (табл.1).

Вторым изучаемым фактором в этом стационарном опыте является система удобрений (табл.1). Диапазоны доз удобрений определены на основе балансового метода с учетом планируемой урожайности требуемого качества продукции, заданных темпов плодородия почв, благоприятного состояния окружающей среды.

Третьим фактором, изучаемым в опыте, является система защиты растений от вредителей, болезней и сорняков. Во всех вариантах опыта предусматривается протравливание семян инсектофунгицидами.

Четвертым фактором, изучаемым в опыте, является система основной обработки почвы. При этом в опыте применяется рекомендуемая (применяемая в зоне) обработка.

При разработке настоящей программы за основу взята схема многофакторного опыта (4*4*4)*3. Она предназначена для изучения плодородия почвы, системы удобрений и системы защиты растений в дозах 0,1,2,3 при рекомендуемой обработке почвы.

Площадь делянки общая: 4,2*25,0 м = 105 м2, учетная 2,0*17,0=34 м2. повторность опыта - трехкратная. Каждое поле севооборота имеет 144 делянки (72 делянки*2 блока) и занимает площадь 1,75 га (160 м*109,2 м).